光响应相分离在生化反应调控中的应用探究

作者：Tsinghua iGEM 2019团队 (陈泊文 陈春宇 方萌 冯思特 付嘉乐 高吉 黄子康 李佳颐 刘泓睿 卢亘哲 青楚珩 孙立泽 翟紫含 周立群)

指导老师：陈国强 孙之荣 李鹏

关键词：液液相分离 光敏感 时间分辨率 酶促反应

摘要

细胞分区对于高效和有组织的细胞内活动是至关重要的，然而人工控制特定反应在特定细胞分区中进行仍然是一个挑战。本项目利用对光诱导响应的蛋白液液相分离作为大肠杆菌中的一个开关，以高时间分辨率的方式将酶组织到不同细胞区域中，以操纵细胞内的生化反应。通过依据液液相分离的特点选取特定底物，并驱动酶进出相，我们可以用光控制酶反应的整体效率。此外，我们也尝试了用形态工程细胞系解释在大肠杆菌中形成的液液相分离的原理。并且提出了依据相分离的空间分布特征调控更广泛生命活动的潜在应用。

【视频：项目介绍1】【视频：项目介绍2】【视频：项目介绍3】

将蛋白质的液液相分离引入大肠杆菌

首先，我们将在真核生物中被广泛研究的蛋白液液相分离现象引入了合成生物学模式生物大肠杆菌。我们观察到，在适当蛋白表达强度下，液液相分离成核大约发生于15分钟左右，而达到稳定尺寸需要30分钟左右（图1）。然后，我们观察了蛋白质液滴在细菌内的形态，发现不同的相分离蛋白在细菌中形成的分区在大小达到稳定后数量和形状并不相同（图2）。随后，我们选择了其中几种蛋白质液滴，利用荧光漂白恢复技术对其流动性进行了验证，为后续其它蛋白和小分子进出该区域提供理论支持（图3）。随后，我们观察到了相分离在形态工程菌（基因组复制但菌体不分裂）中和DNA相间分布的现象，推测核酸静电排斥，可能是决定相分离形成位置的主要因素（图4）。

实现大肠杆菌内蛋白分布对光调控的响应

随后，我们在相分离骨架蛋白上融合了光响应蛋白，使得其在激光照射下能够与细胞中其它区域的另一个光相应蛋白发生结合。得益于大肠杆菌内部空间有限的优势，在给予光信号后，两种光响应蛋白能够迅速发生结合。在几秒内，原来在菌体弥散分布的光敏蛋白将被招募到预先形成的蛋白质液滴中（图5）。接着，我们也验证了在停止激光诱导后的十分钟内，被招募的光响应蛋白将重新均匀分布到整个细胞中。并且该过程可以被反复诱导。

探究光响应蛋白液液相分离对生化反应的调控作用

为了让细胞分区更显著地增加生化反应速率，我们依据相分离蛋白骨架的结构特点，选择了可能被富集到蛋白质液滴中的底物（主要为带有π键的小分子）。接着，我们观察了在光照条件下，有（exp）和没有（ctrl）蛋白质液滴的细胞中的酶促反应的速率。发现在实验组中，酶促反应速率在酶表达量较高而底物相对缺乏的情况下能够被提高1.5倍左右（图6）。

致谢

我们诚挚感谢三位指导老师，王宣师兄，以及陈心怡、葛霄飞、王庭萱、严齐等iGEM2018队员对本项目的指导和帮助。感谢李丕龙老师实验室和尼康影像中心对本项目提供实验原料及技术支持。同时也感谢生命学院学堂班为本项目提供经费支持。

项目网页：https://2019.igem.org/Team:Tsinghua

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