基于CRISPR/Cas12a的AFB1快速检测技术

作者：王鸿奎  化工系

指导老师：张翀  化工系

关键词：CRISPR/Cas12a  Aptamer  AFB1  快速检测

摘要

黄曲霉存在于日常生活中腐烂的各种有机质上，包括米饭、面包、植物油等，呈灰绿色团簇状；其会产生数种代谢产物，其中以AFB1毒性最高，被规定为一类致癌物。现有的检测手段停留在分析化学层面，其能耗高、耗时长、对操作人员要求高等不足使得很难被运用到日常居家检测和食品加工产业实时监测。本文开发了一种基于分子生物学，利用CRISPR/Cas12a的快速、低成本检测方法，使得AFB1检测可以走出实验室，为更多大众提供检测条件。

现有AFB1检测技术概述

我国国标规定，对相关食品中AFB1含量的检测必须基于TLC、HPLC、LC-MS/MS、ELISA四种方法（图1），作为传统的小分子检测和物质鉴定手段，其具有高灵敏度、鲁棒性较好、结果可靠等优点，但同时由于其繁琐的前处理步骤和复杂的仪器应用，同样有检测过程能耗高、耗时长、对检测人员要求高等不足。

分子生物学概念辨析

CRISPR是被发现在细菌体内存在的一种自我防御机制，当遭到病毒侵染时，其可将该病毒的部分保守序列剪切后插入自己的CRISPR系统中，并将其作为病毒的“名片”；当该病毒再次侵染时，其会启动自己的酶切机制，将病毒遗传序列消解吸收，从而保护自己不被裂解死亡（图2）。

Cas蛋白是细菌防御病毒时起到识别和剪切作用的一类蛋白，有不同亚型，其可与前导RNA（gRNA）结合形成复合物；gRNA有一段长20碱基左右的序列，由于碱基互补配对原则，该段序列可以和特定的识别、待剪切序列结合，然后激活Cas蛋白的剪切活性，在特定位点剪切被识别序列，起到基因编辑的作用（图3）。同时，本实验选择两端分别修饰有荧光-淬灭基团的Probe作为信号检测，而Cas12a恰有非特异性位点，即在剪切目标链的同时会剪切周围的寡聚核苷酸链；当未被切割时，荧光基团和淬灭基团距离较近，表现为荧光较弱，反之则强。

Aptamer是一种具有特定二级结构、能与特定小分子等特异性识别并结合的寡聚核苷酸链，其可用SELEX技术进行高通量筛选（图4）。实验拿到了AFB1的aptamer序列，并通过文献调研保证了其特异性，但其结构未知，可作为本课题附加成果之一。

实验原理及总结

本实验选用既能和AFB1结合，又能和Cas12a/gRNA复合物结合的aptamer作为“桥梁”。当体系中没有AFB1时，所有的aptamer都能和Cas12a/gRNA结合，从而激活大量Cas12a来剪切周围probe，使得整体荧光很强；当含有AFB1时，其会与Cas12a/gRNA竞争结合aptamer，使得被激活的Cas12a减少，从而使被剪切的probe减少，整体荧光值下降。基于此，选择某一时间点下的荧光强度，便可回归出荧光强度与AFB1浓度的关系曲线，然后以标准曲线的思路去得到未知样品的浓度，达到检测AFB1的目的（图5）。

本实验开发出了基于CRISPR/Cas12a的AFB1快速检测技术，“一锅端”的检测思路极大地简化了样品前处理过程，同时生物监测使得环境条件更加温和，并能将检测时长从传统方法的2-4h缩短到20mins，且有极大的设备化潜能，以后有望应用于家庭中AFB1的快速自检，保证食品安全。